【作者】王芬 朱平

【機構】北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室

【摘要】7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2是克隆自真菌香菇的兩個雙功能酶(序列一致性97%),具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶雙重活性,能特異性地水解移除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等紫杉烷上的木糖基。采用生物信息學方法對兩個酶蛋白進行酶活性中心預測,初步確定Asp300和Glu529分別為親核試劑和一般酸/堿催化劑,而Asn172-Gly173-Arg174和Lys207-His208為底物結合結構域。以LXYL-P1-2為研究對象,以畢赤酵母細胞為表達宿主,應用定點突變技術獲得了N172A、G173A、R174A、K207A、H208A、D300N和E529Q突變體,并進行了酶活性分析。結果顯示:在分別以PNP-Xyl、PNP-Glc和7-木糖-10-去乙酰紫杉醇為底物時,N172A、G173A、R174A、K207A、D300N和E529Q的β-木糖苷酶與β-葡萄糖苷酶活性大幅度下降甚至完全消失;H208A的β-木糖苷酶活性也顯著下降,但仍保持98%的β-葡萄糖苷酶活性。其結果初步驗證了對上述兩個酶蛋白的活性中心的預測,為進一步揭示7-木糖紫杉烷糖基水解酶結構與功能的關系提供了實驗依據(jù)。 

【基金】國家自然科學基金(No.30770229； No.31270796)；

【關鍵詞】香菇; β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶; 酶活性中心預測; 定點突變; 酶活性分析;