王謙1，閆蕾蕾1，王超1，冀宏2，丁萬杰2，劉傳斌3，邢志華3，李寶佳3

(1河北大學生命科學學院食藥用真菌研究所，保定071002；

2河北省微生物研究所，保定071051；3保定市農(nóng)業(yè)科學研究所，保定071000)

茯苓(P0r／a COCOS)又名茯菟，屬擔子菌亞門，多孔菌科，臥孔菌屬…，是我國傳統(tǒng)的常用中藥材，具有益脾健胃，安神守心，利水滲溫等功能[2]，開發(fā)價值及應用前景遠大。運用發(fā)酵工程手段，可在短時間內(nèi)獲得大量茯苓菌絲體，進而進行工業(yè)化開發(fā)，這吸引了菌物學工作者的注意。本文報道了在工業(yè)發(fā)酵條件下茯苓的液體培養(yǎng)情況及其營養(yǎng)濃縮液的相關檢測。

1材料與方法

1．1供試菌株

茯苓菌株HPC-1，由河北大學生命科學學院食藥用真菌研究所提供，4℃低溫保存，每6個月轉管一次。

1．2主要設備

P270雙層搖床，武漢科學儀器廠產(chǎn)品；100L和1000L不銹鋼通用型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司產(chǎn)品；Beckman Du一7型紫外分光光度計，美國Beekman公司出品。

1．3發(fā)酵工藝

1．3．1發(fā)酵培養(yǎng)基在適宜碳氮源試驗基礎上，確定供試培養(yǎng)基為：玉米粉0．5％，豆餅粉0．5％，葡萄糖2．5％，酵母膏0．3％，磷酸二氫鉀0．1％，硫酸鎂0．1％，pH自然。

1．3．2發(fā)酵培養(yǎng)條件菌種使用前于室溫下活化過夜，再于25±1℃下，24h前180r／min、其后220r／rain搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)周期196h。發(fā)酵罐培養(yǎng)中，O．11rnPa空消50rain，后O．10mPa實消30min，裝液量60％，加消泡劑0．01％，冷卻至25℃壓差法接種。菌齡96～120h，通氣量1：0．5～1：1。經(jīng)工藝優(yōu)化篩選試驗后確定的茯苓發(fā)酵工藝流程為：

放罐標準為菌絲生物量達到30g/100mL(鮮重)，無雜菌，鏡檢菌絲無破壁現(xiàn)象，鎖狀聯(lián)合豐富。醪液經(jīng)破壁處理、低溫提取、減壓濃縮后即獲得其營養(yǎng)濃縮液，進而進行相關檢測。

1．4分析測試

1．4．1常規(guī)分析以80目銅絲網(wǎng)過濾稱重，測定菌絲體鮮重；用pHS-3型數(shù)字式pH計測定 pH值；用菲林法測定還原糖[3]；用酚一硫酸法測定多糖含量[4]；用日立835-50型氨基酸自動分析儀測定氨基酸；用色譜質(zhì)譜聯(lián)測分析測定發(fā)酵液中的有機酸含量，該檢測由河北大學理化中心完成。

1．4．2營養(yǎng)濃縮液的動物試驗按照衛(wèi)生部保健食品功能學評價程序與檢測方法中有關內(nèi)容和試驗方法進行抗疲勞作用檢測(負重游泳試驗)和免疫調(diào)節(jié)作用檢驗(遲發(fā)型變態(tài)反應試驗，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬紅細胞試驗)，試驗動物由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1．4．3營養(yǎng)濃縮液理化分析及毒性試驗試驗由河北省衛(wèi)生防疫站完成，急性毒性試驗用霍恩法進行。

2結果-9分析

2．1搖瓶試驗

0-48h為適應期，菌絲生長緩慢；48～144h為增殖期，菌絲生長速率加快；144h后則進入穩(wěn)定期，菌絲生物量基本保持在一個水平(表1)。在正常培養(yǎng)情況下，進入增殖期后伴隨著菌絲生物量的增長，pH值急劇下降，降至2．5左右才趨于穩(wěn)定。

大部分食(藥)用菌液體深層培養(yǎng)過程中pH值變化不大，相比之下，茯苓液體深層培養(yǎng)情況較為特殊，其還原糖的消耗速率亦較靈芝和金針菇的慢[5,6]，筆者在香菇液體深層培養(yǎng)過程中亦曾發(fā)現(xiàn)同樣的情況L7 J，為此我們測定了發(fā)酵液的有機酸組成(表2)。

其中，274峰為軟脂酸十六烷酸，351峰為硬脂酸十八烷酸，二者均是亞油酸和亞麻酸的重要合成前體，哺乳動物是不能自身合成這些生物膜的重要組成成分的。茯苓液體深層培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的軟脂酸和硬脂酸不僅具有學術價值，也具有潛在的經(jīng)濟價值。該方向的研究將繼續(xù)深入進行。

2．2發(fā)酵罐培養(yǎng)

由于發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)于搖瓶，因此培養(yǎng)周期較短，120h即可達到30d100mL的生物量指標，放罐進入后處理。研究中發(fā)現(xiàn)，將裝液量調(diào)整為50％后，可通過調(diào)整通氣量來改善發(fā)酵液中的溶氧量。在培養(yǎng)中期停止攪拌以減少機械作用對菌絲的破壞作用，是一項有效的工藝。菌種上罐前經(jīng)24h肉湯培養(yǎng)，結合鏡檢確認有無雜菌感染，是一種穩(wěn)妥的菌種檢驗方法。

2．3營養(yǎng)濃縮液的相關檢測

培養(yǎng)120h的茯苓發(fā)酵醪液經(jīng)細胞破壁處理，低溫提取，減壓濃縮，復配和穩(wěn)定處理等步驟后即獲營養(yǎng)濃縮液。其氨基酸總量≥480mg]lOOmL(其中44％為必需氨基酸)，多糖總量≥5．0mg／mL，總酸≥5．36％，重金屬及微生物指標均符合國家標準。毒性檢驗結果LDso>21．5g/kg，屬于安全無毒。

2．3．1茯苓營養(yǎng)濃縮液的抗疲勞作用 經(jīng)比較，茯苓營養(yǎng)濃縮液可顯著延長小鼠游泳耗竭時間，具有明顯的抗疲勞作用(表3)。

2．3．2茯苓營養(yǎng)濃縮液對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬功能的影響試驗發(fā)現(xiàn)，注射茯苓營養(yǎng)濃縮液組小鼠巨噬細胞的吞噬功能明顯高于對照組(表4)，表明該營養(yǎng)濃縮液具有明顯提高機體免疫功能的作用。

3結論

3．1在本研究提供的條件下，茯苓菌株HPC-1經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)120h后，生物量≥30g／100mL(鮮重)。

3．2發(fā)酵過程中pH驟降，在發(fā)酵液中檢測到了包括十六烷酸、十七烷酸和十八烷酸在內(nèi)的有機酸。

3．3營養(yǎng)濃縮液安全無毒，多糖含量≥5．0mg／mL，氨基酸含量≥480mg/100mL，并具有顯著的抗疲勞作用和提高小鼠巨噬細胞吞噬功能的作用。

致謝：本課題得到河北大學理化中心郭志峰教授、河北醫(yī)科大學張永健教授大力幫助，在此一并致謝

參考文獻

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