近日，北京林業(yè)大學員瑗和戴玉成團隊揭示了天麻微生物組及其與次生代謝物的關系。研究首次探討了天麻內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物（如天麻素和天麻素）之間的關系。研究結果表明，一些優(yōu)勢內(nèi)生細菌（如弧菌屬和鏈球菌屬）與次生代謝產(chǎn)物和生物量呈顯著正相關，表明內(nèi)生菌在天麻活性成分的積累中可能發(fā)揮著重要作用。該研究結果為指導天麻微生物組的管理提供了重要的信息。通過了解天麻微生物組的組成、功能和與宿主相互作用，我們可以開發(fā)出基于微生物組的策略來優(yōu)化栽培條件，提高天麻的產(chǎn)量和質(zhì)量。研究成果發(fā)表在經(jīng)濟作物科學領域TOP期刊 Industrial Crops & Products （IF：5.6）。  

 植物微生物組在植物生長發(fā)育、脅迫響應和次生代謝產(chǎn)物積累中發(fā)揮著重要作用。Gastrodia elata 是一種具有藥用價值的菌異養(yǎng)蘭科植物。G. elata 與微生物之間似乎存在密切而復雜的關系，但目前對這種關系的了解仍然不足。本研究分析了在兩種不同栽培模式下 G. elata 生長過程中內(nèi)生細菌和真菌群落的動態(tài)變化，并進一步利用宏基因組學技術表征了其根際微生物組。此外，還初步探討了 G. elata 內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物之間的關系。結果表明，植物生長階段對多種微生物屬性（α多樣性、群落組成和潛在功能、決定性/隨機性過程和共發(fā)生網(wǎng)絡）的影響遠大于栽培模式。宏基因組學分析表明，G. elata 的栽培過程顯著改變了土壤微生物的組成和功能，微生物物種和功能多樣性與土壤 pH 值和養(yǎng)分密切相關。此外，相關性分析表明，G. elata 塊莖的次生代謝產(chǎn)物（例如，天麻素和天麻素）和生物量與屬于鏈球菌屬、弧菌屬和“未培養(yǎng)的”（乳桿菌目）的幾種內(nèi)生細菌類群顯著正相關。總之，我們的研究結果系統(tǒng)地揭示了與 G. elata 相關的微生物組的組成和潛在功能。本研究為指導 G. elata 的微生物分離和培養(yǎng)提供了寶貴的信息，并促進了 G. elata 及其他蘭科植物的可持續(xù)發(fā)展。

前言

蘭科植物是一個多樣化且廣泛分布的開花植物科。許多蘭科植物被栽培、收獲和交易，用于各種用途，例如觀賞植物、食品和藥用產(chǎn)品。天麻 (Gastrodia elata) 是一種主要分布于亞洲的珍貴腐生多年生蘭科植物，在傳統(tǒng)中醫(yī)中已有 2000 多年的應用歷史?，F(xiàn)代藥理學研究已證明天麻的生物活性成分（例如，天麻素、天麻素）具有神經(jīng)保護、心臟保護、改善學習和記憶等作用。由于長期采集和人類活動造成的棲息地破壞，野生天麻已成為一種脆弱的植物，被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》的紅色名錄物種。20 世紀 70 年代，周某發(fā)現(xiàn)了天麻與蜜環(huán)菌屬 (Mycena) 和蜜環(huán)菌屬 (Armillaria) 真菌之間的共生關系，這隨后促進了天麻的有性繁殖和人工栽培。天麻通過蜜環(huán)菌間接吸收木材中的養(yǎng)分，不依賴化肥和農(nóng)藥的使用，因此被認為是有機草藥的來源。目前，天麻作為重要的藥用作物，在許多亞洲國家，尤其是在中國和韓國得到廣泛種植和利用。

隨著高通量測序和微生物組技術的進步，許多植物的微生物組已被解析?；谀Ｊ街参?(擬南芥) 和主要作物 的研究極大地提高了我們對植物微生物組多樣性、組成和功能特征的理解。大量的、高度多樣化的微生物群落定殖于植物的不同部位，并在促進植物生長、養(yǎng)分吸收和抗病性方面發(fā)揮著重要作用。此外，一些微生物產(chǎn)生的化學物質(zhì)會影響宿主植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，也可能是植物藥用成分的重要來源。作為一種典型的完全菌異養(yǎng)蘭科植物，天麻的生長發(fā)育與微生物聯(lián)系更為密切。更好地了解天麻微生物組組成和功能的概況，對于開發(fā)基于微生物組的可持續(xù)天麻生產(chǎn)系統(tǒng)至關重要。

植物微生物組的組裝從播種后不久就開始，并在植物在宿主和環(huán)境因素的影響下生長過程中發(fā)展。在天麻生產(chǎn)中，天麻通常在春季使用三元套作系統(tǒng)（即木材、蜜環(huán)菌和天麻幼苗塊莖）進行播種，并在冬季或次年春季收獲。一些研究已經(jīng)利用依賴培養(yǎng)和高通量測序技術對天麻微生物組進行了表征。例如，陳等人 (2019) 利用內(nèi)部轉錄間隔區(qū) (ITS) 擴增子測序技術，關注了與天麻萌發(fā)和早期生長相關的真菌群落。Khan 等人 (2024) 利用培養(yǎng)和 16S rDNA 和 ITS 擴增子測序技術分析了天麻不同生長階段根際細菌和真菌群落的動態(tài)特征。然而，天麻塊莖內(nèi)生微生物組物種和潛在功能的動態(tài)變化知之甚少。此外，與許多藥用植物一樣，連作問題是天麻可持續(xù)生產(chǎn)的主要制約因素。土壤微生物群落結構和理化性質(zhì)的改變是連作造成的主要問題。一些基于擴增子數(shù)據(jù)的研究所表明，天麻的連作過程提高了根際微生物群落的豐富度和多樣性，其組成和潛在功能也發(fā)生了顯著變化。與擴增子數(shù)據(jù)相比，宏基因組數(shù)據(jù)可以解析微生物群落的組成（物種或菌株水平）和功能多樣性（包括真核和原核微生物以及病毒）。有必要利用分辨率更高的宏基因組測序技術對與天麻相關的土壤微生物組進行全面表征，以探索連作問題的微生物機制。

植物次生代謝產(chǎn)物具有多種生態(tài)功能和藥理活性。對于藥用植物來說，人們更關注其生物活性成分的含量，這決定了其藥效和經(jīng)濟價值。微生物在植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控中的作用已得到廣泛認可。與藥用模式植物丹參相關的微生物組可以參與丹參酮的代謝途徑并增加其生物量。蒙古黃芪的內(nèi)生細菌與次生代謝產(chǎn)物的積累密切相關，接種內(nèi)生細菌（芽孢桿菌）可以促進次生代謝產(chǎn)物的積累和植物生長。然而，對天麻微生物組與其次生代謝產(chǎn)物之間關系的理解極其有限。

天麻與微生物之間的關系復雜且知之甚少。因此，本研究旨在更好地理解：(1) 天麻生長過程中內(nèi)生群落的動態(tài)變化；(2) 天麻周圍土壤微生物組的組成和功能多樣性；(3) 天麻內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物之間的關系。近年來，仿野生栽培中藥材受到中國地方政府的推廣，并因其生態(tài)友好、產(chǎn)品質(zhì)量高和經(jīng)濟效益顯著等獨特優(yōu)勢而受到消費者的青睞。同樣，仿野生栽培也被廣泛應用于天麻的主要產(chǎn)區(qū)，尤其是在森林資源豐富的中國西南部。然而，在實踐中，連作和林地有限等問題導致人們考慮某些設施栽培技術（例如營養(yǎng)缽栽培）作為中藥材可持續(xù)發(fā)展的可行方案。因此，本研究的另一個重點是表征不同栽培模式下天麻的微生物組?？偟膩碚f，本研究為利用微生物組改善天麻生長微環(huán)境，提高其藥用質(zhì)量和生產(chǎn)力提供了寶貴的信息。

結果與分析

3.1. 內(nèi)生菌群多樣性和群落組成

如圖2a所示，細菌和真菌的α多樣性指數(shù)（Chao1豐富度和Shannon多樣性）在兩種栽培模式下均表現(xiàn)出相似的變化，分別在快速生長期和近成熟期發(fā)生顯著變化。在Gastrodia elata所有生長期中，變形菌門和厚壁菌門是主要的細菌門（相對豐度達90%），而子囊菌門和擔子菌門是主要的真菌門（67.3%）（圖2b）。在屬水平上，假單胞菌屬（20.9%）、弧菌屬（17.5%）和假交替單胞菌屬（12.7%）是主要的細菌屬（表S2）；曲霉屬（10.0%）、馬拉色菌屬（7.7%）和枝孢屬（6.2%）是主要的真菌屬（表S3）。細菌和真菌群落的組成隨植物生長發(fā)生明顯變化。PCoA結果顯示，細菌群落是根據(jù)生長期而不是栽培模式進行聚類的，PCo1和PCo2解釋了45.1%的原始變量（圖2c）。真菌群落之間存在輕微的分離，解釋度僅為16.7%。驗證結果表明，生長期是導致細菌群落差異的主要因素（Adonis檢驗：R2=0.608，P=0.001；Anosim檢驗：R=0.846，P=0.001）（表S2）。真菌群落之間的變異較?。ˋnosim，R=0.322，P=0.001），生長期和栽培模式都不是造成這種變異的主要因素（Adonis檢驗：R2=0.127，P=0.001）。維恩圖顯示了在不同生長期和栽培模式下Gastrodia elata塊莖中共享和獨特的細菌和真菌ASV數(shù)量（圖S1）。在相同生長期內(nèi)，細菌和真菌群落中共享的ASV數(shù)量更多。此外，LEfSe分析結果（所有LDA值>4）顯示，差異細菌屬（生物標志物）為：假單胞菌屬（生長期1）、弧菌屬（生長期2）、假交替單胞菌屬（生長期3）、中華根瘤菌屬（生長期4）以及鏈球菌屬和氣單胞菌屬（生長期5）（圖S2）；差異真菌屬（生物標志物）為：凱斯勒菌屬和層孔菌屬（生長期1）、馬拉色菌屬和枝孢屬（生長期2）、馬拉色菌目未定屬（生長期3）、嗜熱子囊菌屬和伊柳氏菌屬（生長期4）以及優(yōu)盤菌屬、念珠菌屬和絲孢菌屬（生長期5）（圖S3）?？偟膩碚f，Gastrodia elata的生長期對細菌和真菌多樣性和群落組成的影響大于栽培模式。

3.2. 細菌和真菌群落的組成

首先使用最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，然后構建細菌和真菌的零模型（999次隨機化）。圖3顯示了在不同生長期和栽培模式下，決定性（|βNTI|≥2）和隨機性（|βNTI|<2）過程對Gastrodia elata菌群組裝的相對貢獻。我們的結果表明，菌群組裝過程受生長期影響很大，特別是對于細菌群落而言。在細菌群落的組裝中，決定性過程在植物的預發(fā)育期占主導地位，而隨機性過程在后期發(fā)育期占主導地位。真菌群落的組裝在Gastrodia elata的整個生長期中主要由隨機過程主導，但在“仿野生栽培”（IWC）模式下略高于“營養(yǎng)缽栽培”（NBC）模式（84%對71%）。在幼苗期，細菌群落中觀察到主要屬于異質(zhì)選擇的決定性過程（76.2%），而真菌群落中所有隨機過程（96.2%）都屬于未被支配的。在Gastrodia elata和蜜環(huán)菌形成共生關系后，細菌群落中從決定性過程轉變?yōu)殡S機過程，到快速生長期時，完全由隨機過程主導（100%，主要屬于未被支配的和擴散限制）。對于真菌群落，異質(zhì)選擇的相對貢獻在相同的Gastrodia elata生長期內(nèi)逐漸增加。從近成熟期到成熟期，細菌群落中的決定性過程（異質(zhì)選擇和同質(zhì)選擇）逐漸再次增加。相反，真菌群落中同質(zhì)選擇的相對貢獻減少，隨機過程增加?？偟膩碚f，決定性過程對Gastrodia elata細菌群落早期階段的影響更大，而隨機過程則影響整個生長期中的真菌群落。栽培模式對真菌群落組裝過程的影響大于細菌群落。

3.3. 微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡的時間動態(tài)

 進行共現(xiàn)網(wǎng)絡分析以進一步評估生長期和栽培模式對Gastrodia elata微生物相互作用的影響。選擇相對豐度大于0.05%的ASV構建細菌、真菌和細菌-真菌界間網(wǎng)絡（圖4）。細菌和真菌網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)分別如表S5和S6所示。結果表明，細菌和真菌類群在細菌-真菌界間網(wǎng)絡中扮演著不同的角色，細菌網(wǎng)絡的網(wǎng)絡連通性和復雜性（平均度和網(wǎng)絡密度）高于真菌網(wǎng)絡。微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡在不同生長期中發(fā)生了明顯的變化，而在兩種栽培模式下則表現(xiàn)出相似的網(wǎng)絡模式。具體來說，在細菌-真菌界間網(wǎng)絡中，細菌和真菌類群的節(jié)點數(shù)量相似，但連接細菌的邊數(shù)遠大于真菌。值得注意的是，連接細菌和真菌的邊數(shù)極少，這表明真菌和細菌類群之間的相互作用稀疏。此外，細菌網(wǎng)絡中負相關的連接較少，而真菌網(wǎng)絡中的所有連接都是正相關的。網(wǎng)絡的可視化和屬性表明，細菌和真菌網(wǎng)絡主要受生長期影響，尤其是在建立共生和近成熟期，網(wǎng)絡的平均度和平均聚類系數(shù)值明顯增加。至于不同的栽培模式，微生物網(wǎng)絡具有相似的網(wǎng)絡屬性值和可視化網(wǎng)絡圖。但在“仿野生栽培”（IWC）模式下，網(wǎng)絡節(jié)點的物種多樣性更豐富，分類組成中“其他”類群的比例也高于“營養(yǎng)缽栽培”（NBC）模式。這可能表明種植穴中的Gastrodia elata塊莖比相對封閉的系統(tǒng)（如營養(yǎng)缽）更容易獲得并與更廣泛的微生物類群相互作用。

3.4. 內(nèi)生菌群潛在功能的預測

分別使用16SrRNA和ITS擴增子測序數(shù)據(jù)對Gastrodia elata塊莖內(nèi)生細菌和真菌群落進行功能預測。圖S4顯示了基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫的細菌和真菌群落的功能組成。在L1功能水平上，生物合成是主要功能（超過60%），其次是降解/利用/同化（約10%）和前體代謝物和能量的產(chǎn)生（約10%）。至于真菌群落，生物合成（約40%）和前體代謝物和能量的產(chǎn)生（約30%）是主要功能。在L2功能水平上，細菌功能組成中輔因子、輔基、電子載體和維生素生物合成、氨基酸生物合成以及核苷和核苷酸生物合成的相對豐度達到40%。在真菌群落中，核苷和核苷酸生物合成、電子轉移和呼吸作用占主導地位（相對豐度均約為10%）。統(tǒng)計結果表明，總體而言，細菌和真菌群落的主要功能在兩種栽培模式之間差異較小，而在不同生長期之間存在顯著差異。值得注意的是，在植物生長過程中，細菌群落的功能組成變化大于真菌群落。

3.5. 土壤微生物群落的組成和功能多樣性

總的土壤微生物組成包括細菌（89.09%）、古菌（1.41%）、真核生物（0.23%）、病毒（<0.01%）和未分類的微生物（9.27%）。其中，酸桿菌門（40%）、變形菌門（約30%）和放線菌門（約10%）占主導地位；嗜酸鐵細菌屬、慢生根瘤菌屬、硫代沼澤細菌屬和Palsa-504是所有土壤樣品中的主要屬（約30%）（圖S5a和S6）。與擴增子相比，宏基因組測序可以更準確地在物種水平上鑒定微生物。在Gastrodia elata塊莖周圍土壤中相對豐度最高的三個物種是Palsa-360sp003161495s、Gp1-AA133sp003225465s和Palsa-504sp003140115（圖S5a）。物種α多樣性分析顯示，四個組之間Chao1豐富度沒有顯著差異，而DS組的Shannon多樣性顯著高于CK組（圖S5b）。維恩圖結果顯示，大多數(shù)微生物物種是共享的（17952個），只有少數(shù)是獨特的物種（約幾百個）（圖S5c）。PCoA結果顯示，PCo1和PCo2的解釋變量為68.8%，不同組的樣本點有明顯的區(qū)分，尤其是在對照組CK中（圖S5d）。LEfSe分析顯示，BS組與其他組之間沒有差異物種，DS組和LS組分別只有一個差異物種（相對豐度），分別為脫氮菌屬和CAIMXF01sp013289985。CK組中有幾個差異微生物類群，例如Palsa 465、Bog209和UBA9676屬（圖S5e）。

基于KEGG直系同源物（KO）數(shù)據(jù)庫的功能組成表明，代謝途徑的相對豐度最高（約80%），其次是遺傳信息處理（約10%）（圖S7）。在代謝途徑中，氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔因子和維生素代謝以及異生素生物降解和代謝占相對較高的比例（超過50%）（圖5a）。EggNOG注釋結果顯示，代謝是主要功能（C、E、I、P類），并且有一些功能特征不明確（S類，超過10%）（圖S7）。而在碳水化合物活性酶（CAZymes）組成中，糖苷水解酶（GH）和糖苷轉移酶（GT）占相對豐度最高（約70%）。基于三個不同的數(shù)據(jù)庫，PCoA和維恩圖分析的功能組成與分類組成遵循相似的模式。CK組與其他組之間存在明顯的區(qū)分，大多數(shù)功能單元在不同組之間是共享的（圖S7）。

各組的功能多樣性沒有顯著差異（圖5c）。熱圖顯示，各種功能，例如細胞運動，在Gastrodia elata周圍的土壤中富集（圖5d）。差異豐度分析表明，根際土壤微生物群落的一些功能性狀（基于KEGG）顯著高于未種植Gastrodia elata的土壤，例如輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝和細胞運動（表S7）。此外，一些CAZymes的豐度在種植Gastrodia elata后發(fā)生了顯著變化，例如輔助活性（AA10）和糖苷轉移酶（GT7、GT8）增加，而糖苷水解酶（GH33）和碳水化合物結合模塊（CBM60）減少。為了比較Gastrodia elata不同生態(tài)位中微生物的功能組成，MetaCyc數(shù)據(jù)庫也用于宏基因組測序數(shù)據(jù)的功能注釋（圖S8）。內(nèi)生細菌功能與土壤微生物相似，生物合成（約60%）、降解/利用/同化（約10%）和前體代謝物和能量的產(chǎn)生（約10%）是主要的功能組成；生物合成（約40%）和前體代謝物和能量的產(chǎn)生（約30%）是真菌群落的主要功能。

3.6. 土壤理化性質(zhì)對土壤微生物群落的影響

 土壤理化性質(zhì)如表S8所示。種植Gastrodia elata后，土壤pH值顯著增加，AK、TP和AP等養(yǎng)分也增加。值得注意的是，只有pH值在塊莖土壤和CK土壤之間存在顯著差異。進行RDA分析以探討土壤理化性質(zhì)對土壤微生物分類（門水平，前50個）和功能（KEGG 2級，前34個）組成的影響。在RDA排序圖中，RDA1和RDA2對分類組成和功能組成的解釋率分別為57.05%和66.94%（圖S9a）。對于單個土壤因素，只有有效磷對分類組成有顯著影響（R2=0.52，P=0.038）。Mantel檢驗結果顯示，總體而言，土壤特性與土壤微生物的分類和功能組成之間沒有顯著相關性（圖S9b），但全鉀與功能組成之間存在顯著相關性（R=0.57，P<0.01）。此外，Spearman相關分析表明，pH與物種Shannon多樣性指數(shù)呈負相關（R=-0.78，P<0.05），而功能多樣性（KO、Ogs和CAZymes）與pH、有效磷、有效鉀和全鉀呈負相關（P<0.05）（表S9）。

3.7. 內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物的相關性分析

統(tǒng)計結果顯示，NBC-5組（營養(yǎng)缽栽培）中Gastrodin、Parishin B、Parishin C和Parishin A的含量顯著高于IWC-5組（仿野生栽培）（表S10），表明在營養(yǎng)缽中栽培的葛根質(zhì)量優(yōu)于在森林種植孔中栽培的葛根。為了深入了解葛根塊莖中內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物之間的關系，我們使用Spearman相關性分析法分析了細菌和真菌ASVs（相對豐度>0.1%）與六種化合物之間的關系。此外，還分析了六種化合物的總含量和塊莖鮮重與內(nèi)生菌之間的相關性。共有12個細菌ASVs和5個真菌ASVs與次生代謝產(chǎn)物或生物量呈顯著相關（P<0.05），|R|值約為0.40。其中5個細菌ASVs與次生代謝產(chǎn)物呈負相關，它們分別屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、乳球菌屬（Lactococcus）和埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）。次生代謝產(chǎn)物與細菌ASVs之間的正相關關系在線性回歸圖中顯示（圖6）。有趣的是，ASV_14111（弧菌屬，Vibrio）和ASV_19914（乳桿菌目，未培養(yǎng)的，Lactobacillales）與多種成分（Gastrodin、Parishin B、Parishin C和Parishin）以及生物量均呈一致且顯著的正相關，表明它們可能在促進次生代謝產(chǎn)物積累和植物生長方面發(fā)揮作用。對于內(nèi)生真菌，五個ASVs與成分呈負相關，這些ASVs的分類未知（真菌未分類，F(xiàn)ungi incertae sedis）。

結論

通過研究兩種栽培模式下天麻塊莖細菌和真菌群落的動態(tài)變化，本研究系統(tǒng)地了解了天麻微生物組在生長過程中的組成和潛在功能的演替。結果表明，天麻與多種細菌和真菌相關，植物生長階段對多種微生物屬性（α多樣性、群落組成、決定性/隨機性過程和共發(fā)生網(wǎng)絡）的影響遠大于栽培方式。此外，細菌和真菌群落的潛在功能隨著植物生長而明顯變化，細菌群落中生物合成功能占主導地位，而真菌群落中生物合成和前體代謝物和能量產(chǎn)生功能是主要功能。這些結果表明，宿主天麻對植物生長過程中內(nèi)生微生物組的組成和潛在功能具有強大的選擇性調(diào)控作用。本研究首次利用宏基因組測序技術分析了天麻周圍土壤的微生物組成和功能多樣性，并探討了天麻內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物之間的關系。天麻的種植過程改變了土壤理化性質(zhì)和根際微生物群落結構。我們進一步發(fā)現(xiàn)，塊莖中一些優(yōu)勢內(nèi)生細菌（弧菌屬、鏈球菌屬等）與次生代謝產(chǎn)物和生物量呈顯著正相關；它們似乎在天麻活性成分積累中起著關鍵作用?？傊?，我們的研究結果系統(tǒng)地揭示了天麻微生物組的組成和潛在功能，以及內(nèi)生菌對天麻質(zhì)量的影響。結果為指導天麻微生物的分離和培養(yǎng)提供了寶貴的信息，并將有助于促進天麻及其他蘭科植物的可持續(xù)發(fā)展。

來源：分子生藥創(chuàng)新團隊