一、雙孢蘑菇的有性生殖

（一）雙孢蘑菇的繁殖方式

　　雙孢蘑菇的繁殖方式有無(wú)性繁殖和有性生殖兩種。其無(wú)性繁殖是指由母細(xì)胞直接產(chǎn)生子代的繁殖方式。Hayes(1978) 描述了雙孢蘑菇的無(wú)性生殖能產(chǎn)生厚垣孢子和次生孢子，但它們?cè)陔p孢蘑菇的生活史研究中少有提及。雙孢蘑菇有性生殖是其生活史的主要部分。它通過(guò)兩性核在擔(dān)子中的結(jié)合，或兩性細(xì)胞以菌絲融合方式結(jié)合后形成新的個(gè)體。

（二）雙孢蘑菇的有性生殖

　　雙孢蘑菇的有性生殖比較特殊，而且比較復(fù)雜，但也是從擔(dān)孢子萌發(fā)開(kāi)始，經(jīng)過(guò)菌絲體和子實(shí)體兩個(gè)發(fā)育階段，直到新一代擔(dān)孢子產(chǎn)生、成熟而結(jié)束。雙孢蘑菇的有性生殖有兩個(gè)分支：一支是含“＋”“－”兩個(gè)不同交配型細(xì)胞核的擔(dān)孢子，不需要交配就可以完成生活史，另一支是僅含有“＋”核的擔(dān)孢子和僅含“－”核的擔(dān)孢子，萌發(fā)成菌絲后，需經(jīng)交配才能完成生活史。在典型的雙孢蘑菇中，雙孢擔(dān)子占絕大多數(shù)，四孢擔(dān)子為數(shù)較少，所以次級(jí)同宗配合的遺傳方式在其完整的有性生殖生活史中占有很大的比例。也就是說(shuō)，通常，雙孢蘑菇的擔(dān)子上僅產(chǎn)生兩個(gè)擔(dān)孢子，絕大多數(shù)擔(dān)孢子內(nèi)含有“＋”“－”兩個(gè)核，即擔(dān)孢子通常只獲得４個(gè)減數(shù)分裂產(chǎn)物中的２個(gè)。這種異核擔(dān)孢子萌發(fā)出的菌絲是異核的菌絲體，它們不產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合，不需要經(jīng)過(guò)交配就能完成其生活史，因此這種異核擔(dān)孢子是自體可育的。1972年Raper等就詳細(xì)地闡述了雙孢蘑菇特殊的二極性次級(jí)同宗配合的生活史。 此外，雙孢蘑菇的擔(dān)子偶爾也能產(chǎn)生單個(gè)、三個(gè)、四個(gè)甚至八個(gè)擔(dān)孢子。據(jù)統(tǒng)計(jì)，一孢擔(dān)子占3%，二孢擔(dān)子占81.8%，三孢擔(dān)子占12.8%，四孢擔(dān)子占1.2%，五孢擔(dān)子占0.013%，七孢擔(dān)子占0.003%。單核孢子或同核的雙核孢子是以異宗配合的遺傳方式來(lái)完成其生活史的。因此，雙孢蘑菇的有性生殖生活史可以用圖3-1來(lái)表示。

圖3-1 雙孢蘑菇有性生殖生活史(參考《自修食用菌學(xué)》,1987)

1.同核擔(dān)孢子的萌發(fā) 2.同核菌絲體 3.同核菌絲體之間的質(zhì)配

4.異核擔(dān)孢子的萌發(fā) 5.異核菌絲體 6.子實(shí)體

7.擔(dān)子 8.接合的細(xì)胞核 9.第一次減數(shù)分裂

10.第二次減數(shù)分裂 11.異核擔(dān)孢子的形成 12.擔(dān)孢子的彈射

13.同核擔(dān)孢子的形成 14.三孢擔(dān)子 15.四孢擔(dān)子

16.單核擔(dān)孢子 17.單核擔(dān)孢子的萌發(fā)

1992年，在美國(guó)加州發(fā)現(xiàn)了四孢變種。這不但豐富了種質(zhì)資源，也極大地推動(dòng)了性因子的研究，同時(shí)也使得雙孢蘑菇有性生殖生活史的研究得到進(jìn)一步完善。四孢變種的生活史是以異宗配合為主要生殖方式。雜交研究表明，四孢擔(dān)子性狀相對(duì)雙孢擔(dān)子是顯性的，三孢擔(dān)子介于二者之間。下圖為1995年P(guān)hillippe 示意的雙孢蘑菇有性生殖生活史(圖3-2)。

圖3-2 雙孢蘑菇有性生殖生活史(Phillippe,1995)

二、雙孢蘑菇的性特征

　　雙孢蘑菇缺乏一般擔(dān)子菌常有的二個(gè)特性。第一，它的擔(dān)子上通常只形成２個(gè)擔(dān)孢子而不是４個(gè)；第二，它的營(yíng)養(yǎng)菌絲不形成鎖狀聯(lián)合。雙孢蘑菇是同宗配合還是異宗配合的？它的結(jié)實(shí)性是由性因子控制的嗎？它的雙孢擔(dān)子的意義又何在呢？

　　雖然雙孢蘑菇已有３００多年的栽培歷史。但是對(duì)其有性生殖和遺傳基礎(chǔ)的研究和了解卻僅僅開(kāi)始于本世紀(jì)。遺傳標(biāo)記的更新是研究發(fā)展和深化的主要線索。從外觀形態(tài)表型標(biāo)記，如菌落形態(tài)、子實(shí)體特性到生理生化標(biāo)記，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型及抗藥、抗病性標(biāo)記，再到分子水平的同工酶、RFLP、RAPD標(biāo)記，不斷加強(qiáng)著人們對(duì)雙孢蘑菇的遺傳、生理、生態(tài)行為的觀察、分析及判定能力，推動(dòng)著雙孢蘑菇遺傳研究的發(fā)展。然而，取得卓有成效的研究結(jié)果，卻是近幾十年的事。

（一）雙孢蘑菇是次級(jí)同宗配合的物種

　　1929年，Lambert發(fā)表的論文在國(guó)際上首次探討了雙孢蘑菇的性， 他成功地分離出９個(gè)單孢子培養(yǎng)物，結(jié)果表明它們都具有產(chǎn)生正常子實(shí)體的能力。這是人們首次懂得可以用蘑菇孢子萌發(fā)成的菌絲體來(lái)制備生產(chǎn)用種。Sinden(1937)也用單孢子菌株做了試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，事實(shí)上有大約三分之一的單孢子菌株根本就不結(jié)菇。這個(gè)試驗(yàn)首次暗示了蘑菇生殖系統(tǒng)的復(fù)雜性。它的子實(shí)體既產(chǎn)生自體可育的擔(dān)孢子，也產(chǎn)生自體不育的擔(dān)孢子。

　　1943年，Kligman又對(duì)蘑菇生殖系統(tǒng)做了進(jìn)一步的研究， 他證實(shí)了蘑菇能產(chǎn)生自體可育和自體不育的兩種分離物，并用１１個(gè)自體不育的單孢分離物做雜交試驗(yàn)，共做了５５個(gè)配對(duì)組合，結(jié)果有７個(gè)組合恢復(fù)了可育性。Kligman還用5個(gè)分離自棕色菌株的自體不育株和3個(gè)分離自白色菌株的自體不育株配對(duì)雜交，結(jié)果15 個(gè)配對(duì)組合中有3個(gè)產(chǎn)生了子實(shí)體。 盡管他的試驗(yàn)結(jié)果提示了蘑菇可能存在一個(gè)不親和性因子或不親和性系統(tǒng)，但是Kligman的結(jié)論卻是蘑菇是無(wú)性的， 他認(rèn)為蘑菇核的融合在孢子產(chǎn)生之前，是“沒(méi)有遺傳學(xué)意義的殘余特性”。Lambert(1960) 回顧了雙孢蘑菇的遺傳與育種，認(rèn)為只有具不同核的孢子才能形成可育的單孢培養(yǎng)物。他提出一個(gè)遺傳研究的途徑，即從單個(gè)擔(dān)子上分離出一對(duì)孢子，從單孢培養(yǎng)物中分離出同核的部分。Pelham(1967)首次從菌褶上直接分離出擔(dān)孢子，并檢驗(yàn)了從雙孢和三孢擔(dān)子上分離的孢子的結(jié)菇能力。 這項(xiàng)工作成為美國(guó)的 Miller( 1971) 和英國(guó)的Elliott(1972)進(jìn)行蘑菇生殖系統(tǒng)分析的起點(diǎn)。Miller和Elliott都從四孢擔(dān)子上分離出孢子。Miller(1971)研究了12個(gè)此類(lèi)培養(yǎng)物，結(jié)果全部都是不育的。用這12個(gè)培養(yǎng)物配對(duì)培養(yǎng)，66個(gè)配對(duì)組合中有34個(gè)結(jié)菇。Elliott(1972) 分析了一套完整的四分體，結(jié)果表明，6個(gè)可配對(duì)的組合中有4個(gè)結(jié)菇。這些研究提供的證據(jù)表明，雙孢蘑菇中有一個(gè)交配系統(tǒng)在起作用。雙孢蘑菇的性特征介于同宗配合與異宗配合之間，屬于次級(jí)同宗配合類(lèi)型。

（二）雙孢蘑菇的交配親和性受二極性或單因子控制，它的結(jié)實(shí)性依賴于性因子的配合。

　　雙孢蘑菇性因子的遺傳研究主要在兩方面展開(kāi)，一是性因子的極性研究，二是性因子等位基因的尋找與定位。

　　1972年，Miller和Kananen做了較全面的交配試驗(yàn)，結(jié)果表明， 交配親和性受單一因子控制。Ginns(1974)重復(fù)解釋了Miller(1971)的配對(duì)數(shù)據(jù)， 認(rèn)為親和性更可能是受雙因子控制。 但是， 證據(jù)表明是單一因子系統(tǒng)在起作用。 Miller 和Kananen(1972) 所做的進(jìn)一步分析和另外三種蘑菇已被清楚地闡明是由單因子控制結(jié)實(shí)性的事實(shí)(Elliott，1978;Raper，C.A.，1976b)都支持雙孢蘑菇受單因子控制的觀點(diǎn)。

　　進(jìn)一步的研究還表明，雙孢蘑菇的性因子存在著復(fù)等位基因(Raper等， 1972;Elliott，1979;Castle等，1988;Wang等，1990)。Elliott 用分離自一個(gè)棕色菌株的沒(méi)有特定標(biāo)記的分離物與交配型A1與A2培養(yǎng)物間雜交，結(jié)果全部可育。Castle用RFLP為標(biāo)記跟蹤商業(yè)菌株與野生菌株同核體間的雜交時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中三個(gè)同核體兩兩配對(duì)均可雜交成功。Wang等以同工酶為標(biāo)記進(jìn)行高產(chǎn)菌株與優(yōu)質(zhì)菌株的同核體間雜交時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象。 1992 年， 美國(guó)加州發(fā)現(xiàn)了雙孢蘑菇的四孢變種。Micheeline，Lmbernoow 等用四孢變種與傳統(tǒng)的雙孢蘑菇菌株雜交也發(fā)現(xiàn)了性因子等位基因。至此，人們共發(fā)現(xiàn)了14個(gè)雙孢蘑菇性因子等位基因，而且這些等位基因出現(xiàn)的概率均一(Imbernon等，1995)。

　　那么，雙孢蘑菇的性因子與結(jié)實(shí)性的關(guān)系又如何呢? May等(1982)，王澤生等(1990)用經(jīng)同工酶鑒定為雜種F1的培養(yǎng)物做栽培試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此類(lèi)培養(yǎng)物并非全部恢復(fù)可育性，即部分沒(méi)有結(jié)菇。這個(gè)結(jié)果暗示，決定蘑菇細(xì)胞壁親和性的性因子并不保證決定子實(shí)體的發(fā)生。Xu等(1993)用RFLP和RAPD標(biāo)記技術(shù)研究的結(jié)果也認(rèn)為蘑菇子實(shí)體的形成有賴于性因子，但由性可親和的同核菌絲配合形成的異核體并不絕對(duì)保證子實(shí)體的形成。

　　1993年，多倫多大學(xué)生物系的Xu等對(duì)性因子開(kāi)展了染色體與DNA水平上的探討，以RFLP和RAPD標(biāo)記技術(shù)成功地將性因子定位在雙孢蘑菇最大的連鎖群，即染色體 I上。目前距性因子位點(diǎn)最近的遺傳標(biāo)記有35個(gè)遺傳圖距(約600Kb)， 用染色體步查法來(lái)分離性因子仍存在技術(shù)上的困難。

（三）雙孢擔(dān)子核減數(shù)分裂行為的研究

　　雖然，雙孢蘑菇有大約80%以上的擔(dān)子通常是雙孢的，而且， 每個(gè)孢子通常具有２個(gè)不同交配型的核，因此是自體可育的，具有結(jié)菇能力。但是，在蘑菇菌褶上還可觀察到３孢、４孢擔(dān)子等等，這些異常擔(dān)子上的孢子大多數(shù)情況下只得到單個(gè)核，因此無(wú)結(jié)菇能力。就是雙孢擔(dān)子上的部分孢子也是自體不育的，這些孢子雖然具有雙核，但２個(gè)核具有相同的交配型。

　　為什么大多數(shù)雙孢擔(dān)子的擔(dān)孢子具有異核性？為什么有的雙核孢子中的核具親和性，而有的又不親和呢？雙孢擔(dān)子中核減數(shù)分裂產(chǎn)生的四個(gè)核是如何配對(duì)遷移入兩個(gè)孢子的呢？

　　幾十年來(lái)，對(duì)于雙孢蘑菇遺傳方式的研究，始終圍饒著擔(dān)子內(nèi)減數(shù)分裂行為這一主題，其核心問(wèn)題就是減數(shù)分裂產(chǎn)生的四個(gè)核在兩個(gè)孢子中是如何分配的。顯微操作使直接從擔(dān)子上分離單孢子成為可能后，研究者已注意到雙孢蘑菇的孢子多數(shù)是自體可育的。Sarazin于1955年提出在雙孢蘑菇擔(dān)子中，減數(shù)分裂后， 具不同性的兩個(gè)核是非隨機(jī)地遷移入每一個(gè)擔(dān)孢子的。1959年，Evans 研究了擔(dān)子中的減數(shù)分裂，并細(xì)心地觀察了減數(shù)分裂過(guò)程紡綞絲的動(dòng)態(tài)變化，提出較完整的核的非隨機(jī)分離理論。他估計(jì)，在減數(shù)分裂的第一次分裂分離中產(chǎn)生異核體的機(jī)率為80%， 在第二次分裂分離中產(chǎn)生異核體的機(jī)率為60%(圖3-3)。1982年，Royse和May應(yīng)用同工

圖3-3 雙孢蘑菇減數(shù)分裂過(guò)程紡綞絲排列類(lèi)型與異核體產(chǎn)生頻率(Evans,1959)

        酶技術(shù)研究雙孢蘑菇的遺傳，發(fā)現(xiàn)約90% 的單孢子在多個(gè)同工酶位點(diǎn)上是異質(zhì)的，而同核孢子數(shù)不到百分之五，認(rèn)為減數(shù)分裂后非姐妹核有進(jìn)入同一孢子的非隨機(jī)傾向。隨后，Castle等人(1987，1988)以RFLPs為遺傳標(biāo)記分析雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)及大肥菇(Agaricus bitorqus)的種間及種內(nèi)多態(tài)性，Summerbell(1989)用核DNA 的單拷貝探針跟蹤分析了由異核親本產(chǎn)生的單孢子的遺傳物質(zhì)存在情況，Kliush(1992)應(yīng)用RAPD進(jìn)行遺傳親子分析。這些研究均支持上述觀點(diǎn)，即雙孢蘑菇減數(shù)分裂后形成的四個(gè)單倍體核有非姐妹核進(jìn)入同一孢子的非隨機(jī)遷移傾向。核非隨機(jī)遷移行為導(dǎo)致絕大多數(shù)孢子為異核的現(xiàn)象，被解釋為是由于該物種為防止同核體隱性純合可能導(dǎo)致的菌株致殘、致死效應(yīng)，而進(jìn)化出的適應(yīng)性遺傳機(jī)制，該機(jī)制最大程度地保持了親本的異核性質(zhì)。同核菌株在RFLP及RAPD分析研究中均表現(xiàn)為一些電泳譜帶明顯缺失，這一點(diǎn)與王澤生等人(1989)應(yīng)用同工酶鑒定同核子的研究結(jié)果一致。電泳譜帶的缺失可能反映了同核體缺乏執(zhí)行正常生命功能的基因。因此必須注意到，由此導(dǎo)致的不易萌發(fā)、生存能力低下的同核體在實(shí)驗(yàn)觀察中就可能被遺漏，造成觀察中的同核孢子比率偏離真實(shí)比率。

　　事實(shí)上，絕大多數(shù)孢子異核的現(xiàn)象，基本上都是以孢子萌發(fā)成的菌絲體為試驗(yàn)材料進(jìn)行研究的。假如是由于同核體不易萌發(fā)，或生存能力低下造成觀察中同核孢子比率偏低的話，那么，減數(shù)分裂后核是隨機(jī)配對(duì)遷移進(jìn)入孢子的理論就值得重視。1980年Langton和Elliott以營(yíng)養(yǎng)缺陷型為標(biāo)記進(jìn)行研究，提出核的分配過(guò)程是隨機(jī)的觀點(diǎn)，他們著文詳細(xì)闡述了雙孢蘑菇減數(shù)分裂后的四個(gè)核在兩個(gè)孢子中隨機(jī)分配的模型。按此預(yù)測(cè)，一個(gè)孢子接受異核的概率將是接受同核概率的兩倍(圖3-4) ，這和許多檢驗(yàn)?zāi)⒐絾捂叻蛛x物可育性研究者的發(fā)現(xiàn)相一致(Sinden，1937;Kligman，1943;Elliott，1972)。Langton認(rèn)為這是異核孢子占大多數(shù)的原因。

圖3-4 雙孢蘑菇減數(shù)分裂產(chǎn)物隨機(jī)配對(duì)模型(Elliott等,1980)

    　隨機(jī)遷移假設(shè)的重要性是它預(yù)期了基因的分離并可用以繪制基因在染色體上的位置，但在雙孢蘑菇中不易檢測(cè)。Elliott和Challen(1983a) 檢測(cè)了次級(jí)同宗配合的雙孢墨汁鬼傘營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記分離的預(yù)期比例，所獲得的數(shù)據(jù)和原養(yǎng)型對(duì)營(yíng)缺型分離株的5:1的預(yù)期比例完全吻合。1991年， 王澤生等以酯酶同工酶為遺傳標(biāo)記研究標(biāo)記位點(diǎn)EstA，B和C在雜交子二代中的分離與重組行為時(shí)，發(fā)現(xiàn)等位基因的分離比均為1:4:1。這個(gè)結(jié)果支持如下觀點(diǎn):擔(dān)子中減數(shù)分裂產(chǎn)生的四個(gè)核隨機(jī)配對(duì)遷移入兩個(gè)擔(dān)孢子是雙孢蘑菇種的特怔。

圖3-5 雙孢蘑菇減數(shù)分裂核隨機(jī)配對(duì)遷移結(jié)果出現(xiàn)異常擔(dān)子的典型機(jī)率( Elliott,1983)

圖3-5 顯示了雙孢蘑菇生活史中核隨機(jī)配對(duì)遷移的結(jié)果和出現(xiàn)異常擔(dān)子的典型機(jī)率。從另一角度看問(wèn)題，雙孢蘑菇也可能屬于單因子控制的異宗配合的種，但是這種異宗結(jié)合被擔(dān)子的雙孢特性所掩蓋。1992年，在美國(guó)加州發(fā)現(xiàn)了雙孢蘑菇的四孢變種。在這一變種中，四孢擔(dān)子占絕大多數(shù)，異宗配合是其主要的有性生殖方式。