廖劍華 王澤生 陳美元 李洪榮 盧政輝

(福建省輕工業(yè)研究所,福州,350005)

摘要:發(fā)展了一種粗提雙孢蘑菇mtDNA(線粒體DNA)方法,獲得As2796親代及子代系列菌株的mtDNA粗提物，并用HaeⅢ、CfoI、MspI、TaqI等內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行了分析和討論。

關(guān)鍵詞:雙孢蘑菇，mtDNA，限制性酶切

一般食用菌mtDNA占總DNA的比例較高，且mtDNA GC含量比核DNA低，僅30%左右，故用識(shí)別四個(gè)GC堿基對(duì)的內(nèi)切酶對(duì)總DNA進(jìn)行酶切時(shí)，mtDNA因識(shí)別位點(diǎn)少而能保留較大片段，電泳后可直接進(jìn)行多態(tài)性分析[1]。由于雙孢蘑菇細(xì)胞多核，故其mtDNA占總DNA的含量較低，該方法難以顯示mtDNA的清晰帶型[2]。而提取純mtDNA或因操作麻煩，或設(shè)備要求較高，所需的菌絲量也較多，不便進(jìn)行多種菌株的大規(guī)模培養(yǎng)和純mtDNA的提取。故我們發(fā)展了一種折衷的簡(jiǎn)便方法，先粗提雙孢蘑菇的mtDNA，然后用識(shí)別四個(gè)GC堿基對(duì)的限制酶進(jìn)行酶切分析。

1 材料和方法

1.1 菌株:雙孢蘑菇親代菌株8213、02及其雜交子一代菌株W95-2,子二代菌株As2796,子三代菌株4607,以及另一供試菌株751-341由福建省蘑菇菌種研究推廣站提供。

1.2 試劑

1.2.1 酶類:RNaseA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、CfoI、MspI、TaqI購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司。

1.2.2 化學(xué)試劑:Tris堿、飽和酚購(gòu)于上海生工公司，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 菌絲培養(yǎng):各菌株接在PDA液體培養(yǎng)基上，24℃靜置培養(yǎng)15-30天。

1.4 粗mtDNA提取:根據(jù)美國(guó)Sylvan公司提取純mtDNA的方法(私人通信)，并加以修改和簡(jiǎn)化。用兩層紗布過濾菌絲體，加蒸餾水洗一遍，盡量擠干水分。稱重后，按12ml緩沖液/10g菌絲體的比例加入預(yù)冷的BufferA(1.0M蔗糖，0.01m KH2PO4，0.1%BSA，2mM半胱氨酸，1mMEDTA，pH7.2 )，在高速組織搗碎機(jī)中充分破碎，1700g 4℃離心20min，上清用兩層紗布過濾后，15000g 4℃離心20min，用20ml BufferB(0.6M蔗糖，10mM Tris-Cl，pH7.5，2mM EDTA)洗滌一遍，15000g 4℃離心20min，沉淀加2ml BufferC(10mMTris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，100mM NaCl，2%N-十二烷基肌氨酸鈉) 混勻，加RNaseA至0.5mg/ml，30℃水浴30min，酚、氯仿/異戊醇各抽提一遍，加0.1V 3M NaAc(pH5.2)，2V無水乙醇-20℃沉淀2hr，臺(tái)式離心機(jī)收集沉淀，

70%乙醇洗后吹干，溶于適量純水中, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 酶切:用廠家提供的緩沖液，50ul體系，適量DNA和內(nèi)切酶，適宜溫度下酶解2.5hr，加EDTA至10mM終止反應(yīng)。

1.6 電泳:按文獻(xiàn)[3]的方法。檢測(cè)提取的DNA樣品用0.8%瓊脂糖，檢測(cè)酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖，電壓5V/cm。結(jié)束后EB染色觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗mtDNA提取結(jié)果

凝膠電泳分析表明提取的粗mtDNA產(chǎn)量約200-600ng/g濕菌體(混有核DNA)，質(zhì)量尚可，都在20Kb以上，有一定拖尾(圖1)。由于混有核DNA，用常規(guī)的內(nèi)切酶酶切不能得到mtDNA的清晰帶型，因?yàn)楹薉NA酶解后產(chǎn)生的連續(xù)大小彌散狀片段阻礙了mtDNA酶解片段的觀察。但由于mtDNA在提取的混合DNA中的比例大大提高(估計(jì)占60%以上)，使用識(shí)別四個(gè)GC堿基對(duì)的內(nèi)切酶酶切時(shí)，很容易得到清晰的條帶。我們使用四種內(nèi)切酶HaeⅢ(識(shí)別GG'CC)、CfoI(識(shí)別GCG'C)、MspI(識(shí)別C'CGG)、TaqI(識(shí)別T'CGA)對(duì)粗mtDNA進(jìn)行酶切,獲得的片段數(shù)達(dá)15-20條(圖2) ，接近純mtDNA酶切的效果。該提取方法簡(jiǎn)單，操作方便，一次可提取多個(gè)樣品，菌絲體用量介于直接分析法和純mtDNA提取法之間，20g濕菌體提取的粗mtDNA可供10次酶切。

M 1 2 3 4 5 6 7

圖1 雙孢蘑菇粗mtDNA在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離結(jié)果

M:λDNA/EcoRI+HindⅢ Markers,下同。

Fig.1 Electrophoretic pattern of crude mtDNA of A.bisporus on 0.8% agarose gel

M:λDNA/EcoRI+ HindⅢ Markers. Similarly here in after.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

圖2 雙孢蘑菇粗mtDNA內(nèi)切酶酶切圖譜

1道:無酶對(duì)照;2,3;4,5;6,7;8,9道:分別為內(nèi)切酶HaeⅢ,CfoI,MspI,TaqI酶切帶型;2,4,6,8道:2796粗mtDNA;3,5,7,9道:751-341粗mtDNA。

Fig.2 Band patterns of crude mtDNA of A.bisporus by endonuclease digestion

Lane 1:non-enzyme CK; Lane 2,3;4,5;6,7; 8,9:bands of HaeⅢ, CfoI, MspI, TaqI; Lane 2,4,6,8: 2796 crude mtDNA; Lane 3,5,7,9: 751-341 crude mtDNA.

2.2 As2796親子代系列菌株的mtDNA分析

As2796是我站選育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交菌株之一，其親子代關(guān)系如下[4]:

不育單孢分離

8213──────→As165┐雜交 單孢分離 單孢分離

----------不育單孢分離 ├─→W95-2────→ 2796────→ 4607

02 ──────→361-2┘

P Ps F1 F2 F3

異核親本 同核不育株 雜交子一代 雜交子二代 雜交子三代

(P:Heterokaryotic parents; Ps:Homokaryotic infertile isolates; F:Hybrid offspring)

優(yōu)質(zhì)菌株8213和高產(chǎn)菌株02的不育單孢雜交獲得子一代W95-2，再通過連續(xù)的單孢分離獲得子二代2796和子三代4607。mtDNA酶切圖譜(圖3，4)顯示，8213和W95-2、2796、4607具有相同的線粒體基因型，而02不同。這表明了雙孢蘑菇線粒體是單親本遺傳的，雜交菌株W95-2、2796和4607遺傳了優(yōu)質(zhì)親本8213的線粒體。對(duì)2796家系的mtDNA分析也直接驗(yàn)證了Sonnenberg關(guān)于雙孢蘑菇線粒體單親遺傳的論斷[1]。

M 1 2 3 4 5 6

圖3 雙孢蘑菇粗mtDNA的HaeⅢ酶切圖譜

1道:無酶對(duì)照;2-6道: 2796,4607,8213, W95-2,02的粗mtDNA酶切帶型

Fig.3 Band patterns of crude mtDNA of A.bisporus by HaeⅢ digestion

Lane 1:non-enzyme CK; Lane 2-6:Digestion patterns of 2796,4607,8213,W95-2,02

M 1 2 3 4 5 6

圖4 雙孢蘑菇粗mtDNA的CfoI酶切圖譜

1道:無酶對(duì)照;2-6道: 2796,4607,8213, W95-2,02的粗mtDNA酶切帶型

Fig.4 Band patterns of crude mtDNA of A.bisporus by CfoI digestion

Lane 1:non-enzyme CK;

Lane 2-6:Digestion patterns of 2796,4607, 8213,W95-2,02

3 討論

常規(guī)的差速離心法提取純mtDNA[5]，需用 DNaseI消化線粒體沉淀以去除核DNA的污染，再通過反復(fù)洗滌去除DNaseI，純度要求較高的還要用蛋白酶K去蛋白，用超速離心去多糖。該mtDNA粗提法省略了這些步驟，使得操作大為簡(jiǎn)化，也減少了mtDNA的損失。與氯化銫密度梯度離心法提取純mtDNA[1]相比，該法不需超速離心機(jī)及相關(guān)操作。當(dāng)然該法的缺點(diǎn)也是明顯的。由于提取到的是mtDNA粗提物，其應(yīng)用是有限的，只能用幾種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切和線粒體分型，而不便進(jìn)行PCR及雜交等其它分子生物學(xué)操作。

按Sonnenberg對(duì)雙孢蘑菇mtDNA的基因分型[1]，2796線粒體基因型屬Ⅱ型，而02屬Ⅰ型，分別與世界上第一批育出的雜交菌株U3和U1屬同一類型。根據(jù)HaeⅢ酶切結(jié)果，2796與02的mtDNA分別切出15和14條帶，其中共同帶11條，兩者相似值S=2×11/(15+14)=75.9%,相似值較高。而從總DNA獲得的雙孢蘑菇菌株間的遺傳相似值也較高[6]。這些說明了雙孢蘑菇線粒體遺傳的保守性及種質(zhì)基因庫(kù)(包括核DNA和mtDNA)的貧乏。在未來育種計(jì)劃中為了改良商品菌株，含有更多基因變異性的野生菌株具有重要作用。

聯(lián)系我們所做的這些菌株的同工酶譜[7]，2796、8213、02分別屬三種不同的同工酶類型HG4(雜合型)、G(優(yōu)質(zhì)型)、H(高產(chǎn)型)，而線粒體基因型并不能把三種菌株完全分開，暗示了這些由核DNA編碼的同工酶與mtDNA無關(guān)。當(dāng)然這并不說明雙孢蘑菇mtDNA與菌株類型無關(guān)，更深入的實(shí)驗(yàn)還有待繼續(xù)。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Sonnenberg ASM., P.C.C.Van Loon & L.J.L.D. Van Griensven. Mitochondrial genotypes and their ingeritance in the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Genetics and breeding of Agaricus (ed by L.J.L.D.Van Griensven), Wageningen. 1991,42-51.

2 曾凡亞,張義正.食用真菌線粒體DNA的直接分析.微生物學(xué)通報(bào), 1998,25(1):5-9。

3 J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，金冬雁，黎孟楓等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版).科學(xué)出版社.北京.1992,304-318。

4 Wang ZS, Liao JH, Chen MY et al., Molecular Genetic Study on the Family of Hybrid Strain As2796 of Agaricus bisporus, Proceedings of 3rd International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products, Sydney, 1999.66-74.

5 馮國(guó)宏，程文，陸師義.玉米黑粉菌mtDNA的研究.遺傳學(xué)報(bào)，1991，18(4)：378-384。

6 曾偉,宋思揚(yáng),王澤生等.雙孢蘑菇及大肥菇的種內(nèi)及種間多態(tài)性RAPD分析.菌物系統(tǒng), 1999,18(1):55-60。

7 Wang ZS and Wang HC. Isozyme patterns and characteristics of hybrid strains of Agaricus bisporus. Micol.Neotrop.Apl., 1990,3:19-29.

Analysis of Crude mtDNA of Agaricus bisporus by Endonuclease Digestion

Liao Jianhua Wang Zesheng Chen Meiyuan Li Hongrong Lu Zhenghui

(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005)

Abstract: An extraction method for the crude mtDNA of Agaricus bisporus was developed, and the crude mtDNAs of parent and offspring strains of As2796 were obtained and digested by endonuclease HaeⅢ、CfoI、MspI and TaqI, then the digestion results were analyzed and discussed.

Key words: Agaricus bisporus, mtDNA, Endonuclease digestion